Визначення активності ДНКази, 96

НАЗВА ТА ЦІЛЬОВЕ ПРИЗНАЧЕННЯ

Набір для визначення активності ДНКази – це твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА) для кількісної перевірки ДНКази в людській сироватці або ЕДТУ плазмі. Цей аналіз призначається тільки для діагностики в лабораторних умовах.

КОРОТКИЙ ОПИС ТА ВИКЛАДЕННЯ ТЕСТУ

Системний червоний вовчак (СЧВ) є одним з найважчих аутоімунних захворювань, зокрема, яке спричиняється в результаті виробництва патогенних аутоантитіл проти широкого спектру ядерних антигенів, у тому числі хроматину, рібонуклеопротєїдних компонентів (РНП), компонентів структури сплайсосома разом з фосфоліпідними компонентами клітинної мембрани. Передбачається ряд різноманітних клінічних симптомів в поліорганних системах, що переходить в такі хвороби, як гломерулонефрит, васкуліт, артрит, інсульт або розлад центральної нервової системи. 

Були визначені сучасні діагностичні принципи у зв’язку з важкою переносимістю СЧВ. Пацієнти, які страждають від СЧВ, повинні відповідати будь-яким чотирьом з одинадцяти критеріїв, встановлених Американською колегією ревматологів (АКР). Визначення антитіл до двохланцюжкової ДНК разом з антитілами до ядерного Sm білка є діагностичними критеріями АКР. Іншим засобом діагностики є виявлення антитіл до односпіральної ДНК, гестонових білків та нуклеосомних комплексів.

Хоча до сьогоднішнього дня визначення СЧВ залишається нечітким, видається, що порушення в механізмі апоптозу, тобто форми фізіологічної загибелі клітин з метою подальшого видалення небажаних клітин, може викликати сприйнятливість до аутоімунних хвороб. ДНК з відмерлих клітин автоматично засвоюється під час апоптозу і відіграє основу для біологічного захисту проти таких внутрішньоклітинних паразитів, як віруси і бактерії2. Таким чином, відсутність фрагментації ДНК може вплинути на тканинний гомеостаз а, отже, і на розвиток аутоімунних захворювань і раку. Це може бути поясненням, чому у пацієнтів з СЧВ часто високі показники циркулюючих нуклеосом3.

ДНКаза (набір для визначення активності ДНКази) – це фермент, потенційно задіяний в метаболізмі хроматину в результаті разпаду ДНК у випадку апоптозу. Останнім часом дослідження показали, що лінії людських клітин без ДНКази стійкі до апоптозу, спричиненого лікарськими засобами. Крім того, було описано, що трансгенні миші, позбавлені ДНКази, не можуть позбавитись циркулюючих нуклеосом. Ця проблема в апоптозі призводить до розвитку спонтанного вовчакоподібного синдрому (наприклад, гломерулонефрит)3. Дефіцит ДНКази було також виявлено у пацієнтів з СЧВ на підставі високої кількості антитіл проти нуклеосомних антигенів. Діяльність ДНКази часто подавлена у пацієнтів з СЧВ. Було виявлено, що мутація одного нуклеотиду в гені ДНКази I понижує загальну активність цього ферменту. B-клітини у хворих на СЧВ з такою мутацією мають лише 30-50% від потенціалу ДНКази у порівнянні зі здоровими особами. Таким чином, титр імуноглобуліну G (IgG) проти нуклеосомних антигенів був у 7-8 разів вищим у хворих на СЧВ, ніж у хворих на СЧВ без цієї мутації, і у 70-80 разів вище у порівнянні зі здоровими особами4.

Гіпотетична модель описує різні генетичні шляхи розвитку на початку СЧВ патогенезу, враховуючи взаємодію між такими різними генами, як C1q та ДНКаза. Хворі на СЧВ володіють аналогічним серопозитивним фенотипом без серйозних патогенезів захворювання. Причиною цього може бути зменшення активності ДНКази.

Сьогодні людський рекомбінантний фермент ДНКаза I використовується для лікування пацієнтів з муковісцидозом, чиї дихальні шляхи блокуються густим слизом з високою концентрацією бактеріальної ДНК. Нещодавно проводились клінічні випробування фази Ib, де ДНКаза І вводився людям з СЧВ, і було встановлено, що процес лікування є безпечним. Наступним кроком у роботі виступає розробка терапії для хворих на СЧВ з ДНКазою I 5,6.

ІФА ДНКази від ДЕМЕДІТЕК є новим і абсолютно інноваційним аналізом для визначення активності ДНКази. Це перший у світі комерційний аналіз для вимірювання ферментативної активності ДНКази в мікропланшеті. Це може виявитися дуже корисним діагностичним засобом як для визначення та моніторингу, так і для передбачення багатьох аутоімунних захворювань.

Показання до застосування:

• передбачення СЧВ · контроль лікування СЧВ 
• сімейна перевірка (скрінінг) на СЧВ · порушення апоптозу
• контроль лікування ДНКази при муковісцидозі · вірусні та бактеріальні інфекції

ПРИНЦИП ДІЇ ТЕСТУ

Конкретний субстрат ДНКази прив’язується до мікролунки. Будь-яка наявна активність ДНКази передбачає реакцію із встановленим іммобілізованим субстратом набору для визначення активності ДНКази впродовж 60 хвилин при температурі 37°C. Під час мийки мікролунок видаляється неактивна сироватка та плазмові компоненти. Спарений субстрат анти-ДНКази пероксидази хрону (ПК) імунологічно виявляє субстрат ДНКази, що залишився іммобілізованим на мікропланшеті. Під час мийки мікролунок видаляється вільний кон’югат. Субстрат ферменту в присутності пов’язаного кон’югата гідролізується до синього кольору. Додавання кислоти зупиняє реакцію, утворюючи кінцевий продукт жовтого кольору. Інтенсивність жовтого кольору вимірюється фотометрично при 450 нм. Яскравість оберненопропорційна активності ДНКази. Патологічні зразки мають більш високий коефіцієнт зниження рівня активності (%, ЗРА).

ПОПЕРЕДЖЕННЯ І ЗАСТЕРЕЖЕННЯ

1. Усі реагенти цього обладнання призначаються тільки для діагностики в лабораторних умовах.
2. Не замінювати один одним компоненти обладнання з різних партій.
3. Компоненти, що містяться у сироватці крові людини, було перевірено і підтверджено на відсутність поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HbsAg), РНК вірусу гепатиту С (HVC), ВІЛ1 і ВІЛ2 на основі офіційних методів Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів (США). Жодна перевірка не може гарантувати відсутність поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HbsAg), РНК вірусу гепатиту С (HVC), ВІЛ1 і ВІЛ2, тому робота з усіма реагентами на основі сироватки крові людини у цьому обладнанні повинна передбачати можливість передачі ними інфекцій.
4. Уникати контакту з TMБ (3,3 ‘, 5,5’-тетраметил-бензидин). Якщо TMБ вступає в контакт зі шкірою,  необхідно ретельно промити її водою з милом.
5. Уникати контакту зі стоп-реагентом, який є кислотою. Якщо він вступає в контакт зі шкірою, необхідно ретельно промити її водою і звернутися до лікаря.
6. Деякі компоненти обладнання (наприклад, управління, буфер для зразка та буферний розчин для промивання) містять азид натрію у якості консерванту. Азид натрію (NaN3) є високотоксичним і реактивним у чистому вигляді. Рівень техніки безпеки дотримується за умови концентрації продукту (0,09%). Незважаючи на класифікацію як безпечної речовини, ми настійно рекомендуємо обачливо використовувати її в лабораторних умовах (див. п. 8., 9., 10).
7. Деякі компоненти обладнання містять ПроКлін 300 (ProClin 300) у якості консерванту. При утилізації реагентів, які містять ПроКлін 300, необхідно промити трубки великою кількістю води, щоб  розбавити компоненти нижче активного рівня.
8. Носити одноразові рукавички під час роботи із зразками і комплексними реагентами, ретельно вимити руки після цього.
9. Не піпетувати ротом.
10. Не приймати їжу, пити, курити, наносити макіяж в місці, де використовуються зразки і комплексні реагенти.
11. Уникати контакту між буферним розчином перекису і матеріалами, які легко окислюються; крайня межа температури може ініціювати самозаймання.

Дотримуватись керівних принципів контролю якості в медичних лабораторіях шляхом аналізу контрольних речовин та/або змішаної сироватки. Дотримуватись існуючих правових норм під час роботи з усіма комплексними реагентами, контрольними речовинами та зразками сироватки.

ВМІСТ КОМПЛЕКТУ

Розмір упаковки 96 детерм.

Кількість 1 Ділимий мікропланшет, що складається з 12 модулів по 8 лунок кожен, покритих специальним субстратом ДНКази. Готовий до використання.

6 флаконів, 1,5 мл кожен Калібратори, які передбачають зниження рівня активності ДНКази (ЗРА) (A-F). 5, 15, 35, 50, 75, 100% ЗРА/мл Готовий до використання.

2 флакона 1,5 мл кожен контрольні речовини набору для визначення активності ДНКази в позитивному (1) і негативному (2) буферному матрексі. Готовий до використання.

1 флакон, 20 мл Буфер для зразка (тріс, NaN3 <0,1% (вагове співвідношення)), жовтий колір, концентрат (5х).

1 флакон, 15 мл Розчин ферментного кон’югату (фізіофосфатний розчин з фосфатним буфером, ПроКлін 300 <0,5% (об./об.)), (світло-червоний), що містить поліклональний шкідливий імуноглобулін G кролика; маркований пероксидазою хрону. Готовий до використання.

1 флакон, 15 мл Розчин субстрата ТМБ. Готовий до використання.

1 флакон, 15 мл Стоп-реагенг (містить кислоту). Готовий до використання.

1 флакон, 20 мл Промивний розчин (PBS, NaN3 <0,1% (в /)), концентрат (50х).

УМОВИ ЗБЕРІГАННЯ ТА СТАН РІВНОВАГИ

1. Зберігати при температурі 2-8°C.
2. Зберігати чарунки мікропланшета закритими в сухій упаковці з вологопоглиначем.
3. Реагенти стабільні до закінчення терміну дії обладнання.
4. Не піддавати реагенти впливу тепла, сонця або яскравого світла під час зберігання та використання.
5. Буфер для розведеного зразка і промивний буфер стабільні впродовж 30 днів при температурі 2-8 ° C.

НЕОБХІДНІ МАТЕРІАЛИ

Обладнання

– Зчитувач мікропланшету, здатний на вимірювання кінцевих точок при 450 нм

– Багатоканальний диспенсер або піпетка на 100 мкл з високою повторюваністю по точності

– Вихровий змішувач

– Піпетки на 10 мкл, 100 мкл і 1000 мкл

– Лабораторний пристрій для відрахування часу

– Програмне забезпечення для скорочення даних

Підготовка реагентів

– Дистильована або деіонізована вода

– Мірний циліндр на 100 і 1000 мл

– Пластиковий сосуд для зберігання миючого розчину

НАБІР ЗРАЗКІВ. УМОВИ ЗБЕРІГАННЯ ТА РОБОТИ З НИМИ

1. Зберігати всі зразки крові у відповідних медичних технічних засобах, щоб уникнути гемолізу.
2. Дозволити згортання крові і відокремити сироватку шляхом центрифугування.
3. Тест-сироватка повинна бути чистою та без гемолізації. Забруднення через гемоліз або ліпемію краще уникати, але вони не перешкоджають проведенню цього аналізу.
4. Зразки можуть зберігатися при температурі 2-8°C впродовж п’яти днів, або при температурі -20°C – до шести місяців.
5. Уникати повторного заморожування і відтавання зразків. Це може призвести до змінної втрати активності антитіл.
6. Випробування сироватки, інактивованної випробуванням, не рекомендується.

ПРИМІТКИ ЩОДО ПОРЯДКУ ДІЙ

1. Не використовувати компоненти обладнання після закінчення їх терміну дії.
2. Не замінювати один одним компоненти обладнання з різних партій.
3. Усі матеріали повинні зберігатись при кімнатній температурі (20-28°С).
4. Кришки з шести флаконів калібратора не замінюються одна на іншу за будь-яких обставин з метою уникнути забруднення.
5. Забезпечувати наявність усіх реагентів та зразків, готових до аналізу. Після початку тест  повинен здійснюватись без зупинок з метою отримати найбільш чіткі та надійні результати.
6. Виконувати аналіз у встановленому порядку.
7. Завжди використовувати свіжі розчини зразків.
8. Піпетувати всі реагенти та зразки на дно чарунки.
9. Замінити головку піпетки між зразками та різними контрольними речовинами, щоб уникнути перехідного забруднення.
10. Важливо ретельно промити мікрочарунки і видалити останні краплі промивного буфера для досягнення найкращих результатів.
11. Усі інкубаційні етапи повинні чітко відповідати часовому графіку.
12. Контрольні зразки сироватки або фонд крові повинен постійно аналізуватись як невідома величина для перевірки ефективності реагентів та аналізу.
13. Повторно не використовувати чарунки мікропланшету.

Щодо усіх контрольних речовин надається відповідна інформація про концентрації на етикетці кожного флакону. За допомогою цих даних може бути розрахована калібрувальна крива для напівкількісного зчитування результатів аналізів пацієнта.

ПІДГОТОВКА РЕАГЕНТІВ

Підготовка розчину для промивання

Розвести перед використанням вміст кожного флакону буферного концентрату розчину для промивання (50х) дистильованою або демінералізованою водою до остаточного об’єму 1000 мл. Зберігати охолодженим: постійно при температурі 2-8°C впродовж щонайменше 30 днів після підготовки або до закінчення терміну придатності, зазначеної на етикетці.

Увага: Цей промивний буфер передбачається спеціально для цього аналізу.

Підготовка зразків

Розвести усі зразки 1:100 із буфером для зразку перед проведенням аналізу. Після цього змішати 10 мкл зразка з 990 мкл буферу для зразка в полістирольній трубці. Все добре перемішати. Контрольні речовини готові до використання і не повинні бути розбавленими.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

1. Підготувати достатню кількість мікропланшетних модулів для розміщення контрольних речових і заздалегідь розведених зразків для пацієнтів у двох екземплярах.

Рис. 1

standards A to F – стандарти від A до F

patient sample 1, 2,.. – зразок для пацієнта 1, 2,..

positive control – регулювання з підвищенням

negative control – регулювання зі зниженням

2. Закапати піпеткою 100 мкл калібратора (використання окремі головки для піпетки), контрольних речовин та розведеного зразка для пацієнта в чарунки.
3. Закрити мікропланшет (парафільмом, ущільняющою фольгою або кришкою) та інкубувати на 60 хвилин при температурі 37°C.
4. Обережно зняти кришку. Видалити вміст з чарунок і промити 3 рази 300 мкл розчину для промивання.
5. Внести по 100 мкл розчину ферментного кон’югату в кожну чарунку.
6. Інкубувати впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі.
7. Видалити вміст з чарунок і промити 3 рази 300 мкл розчину для промивання.
8. Внести по 100 мкл розчину субстрату ТМБ в кожну чарунку.
9. Інкубувати впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі.
10. Додати 100 мкл стоп-реагенту в кожну чарунку модулів і залишити недоторканими впродовж 5 хвилин.
11. Вважати оптичну щільність на рівні 450 нм та обчислити результат. Рекумендується бі-хроматичне вимірювання з посиланням на 600-690 нм.

Отриманий колір залишається стабільним впродовж 30 хвилин. У цей час необхідно враховувати оптичну щільність.

РОЗ’ЯСНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

Контроль якості

Результати цього тесту вважаються дійсними тільки якщо оптична щільність 450 нм як для регулювання з підвищенням (1) і регулювання зі зниженням (2), так і для калібратора А і F знаходиться у відповідному діапазоні, зазначеному в свідоцтві контролю якості, який додається до кожного тест-набору! Якщо будь-який з цих критеріїв не виконується, результати є недійсними, а тест слід повторити.

Розрахунок результатів

В рамках аналізу ДНКази у 4-параметровій схемі з лінійно-логарифмічними координатами для визначення оптичної щільності і концентрації використовується метод відбору та обробки даних.

Рекомендована лінійно-логарифмічна ділянка

Спочатку необхідно розрахувати середню оптичну щільність для кожної чарунки калібратора. Після цього побудувати на лінійно-логарифмічному діаграмному папері середню оптичну щільність кожного калібратора від концентрації. Намалювати оптимальну криву відповідно до шляху усіх позицій калібратора. Позиції калібратора також можуть складатися у прямі відрізки. Концентрація невідомих речовин у такому випадку може бути оцінена по калібрувальній кривій через інтерполяцію.

Приклад розрахунку

На малюнку нижче показані типові результати аналізу ДНКази. Ці дані призначаються для використання тільки у якості прикладу і не повинні використовуватись для обчислення результатів в інших випадках.

Калібратори 

No Положення OD 1 OD 2 Серед. Рез.1      Рез.2    Серед.  Заявл. Крайн. КВ [%]

ST1 A1/A2 0.067 0.067 0.067  4.5   4.5         4.5     5   0

ST2 B1/B2 0.317 0.314 0.316  15.9   15.8      15.8     15   1

ST3 C1/C2 0.800 0.763 0.781  35.4   33.9      34.7     30   1

ST4 D1/D2 1.175 1.169 1.172  51.2   50.9      51     50   1

ST5 E1/E2 1.588 1.714 1.651  70.2   76.5      73.4     75   1

ST6 F1/F2 2.159 2.139 2.149  101.5   100.3   100.9       100   1

Тлумачення результатів

Під час стандартних умов дослідження із зразками сироватки крові здорових донорів були встановлені наступні діапазони в результаті ІФА ДНКази:

Зріз

Сироватка 25 % AR

Плазма 25 % AR

Позитивні результати необхідно перевірити стосовно всього клінічного стану пацієнта. Крім того, кожне рішення терапії слід приймати індивідуально для кожного пацієнта. Рекомендується, щоб кожна лабораторія встановлювала свій власний діапазон нормальних і патологічних результатів.

РОБОЧІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Точність (відтворюваність результатів)

Статистика коефіцієнтів варіації (КВ) була розрахована для кожного з трьох зразків на основі результатів 24 аналізів в один захід для отримання середньостатистичного рішення. Серійня точність була розрахована за результатами 5 різних заходів з 6 аналізів кожен:

Межа визначення результатів

Нижня межа визначення результатів під час аналізу ДНКази становить 0,3 пг/мл ДНКази. Це відповідає 1μKuU/мл.

Специфічність

Мікропланшет покривається специфічним субстратом ДНКази.

Калібрування

Кількісне калібрування під час аналізу ДНКази здійснюється на основі певної концентрації ферменту ДНКази, що визначається в одиницях Куніц.

Діапазон калібрування: 1 – 100% зниження активності (ЗА), відповідно до 5000 – 0,3 пг/мл ДНКази або 16 mKuU – 1 μKuU/мл.

ОБМЕЖЕННЯ В РАМКАХ ПРОВЕДЕННЯ ПРОЦЕДУРИ АНАЛІЗУ

Аналіз ДНКази є діагностичною допомогою. Конкретний клінічний діагноз не повинен грунтуватися на результатах одного тесту, лікар повинен оцінити усі клінічні та лабораторні дослідження.

ЗАВАЖАЮЧІ РЕЧОВИНИ

Не зафіксовано будь-яких порушень структури гемолітичної (до 1000 мг/дл), ліпемічної (до 3 г/дл тригліцеридів) або білірубінної (до 40 мг/дл) сироватки. Також було дотримано порядку використання антикоагулянтів. Проте з практичних міркувань рекомендується уникати грубо гемолізованих або ліпемічних зразків.

ПОСИЛАННЯ

1. Wakeland E. K., Liu K., Graham R.R., Behrens T.W. Delineating the genetic basis of Systemic Lupus Erythematosus. Immunity 2001; 15: 397-408.
2. Vaux D. L., Flavell R. A. Apoptosis genes and autoimmunity. Current Opinion in Immunology 2000, 12: 719-724.
3. Zhang J, Xu M. Apoptotic DNA fragmentation and tissue homeostasis. Trends in Cell Biology

2002; 12: 84-89.

4. Yasutomo K., Horiuchi T., Kagami S., Tsukamoto H., Hashimura C., Urushihara M., Kuroda
5. Mutation of DNase I in people with systemic lupus erythematosus. Nature Genetics 2001, 28: 313-314.
6. Walport M. J., Lupus, DNase and defective disposal of cellular debris. Nature Genetics 2000, 25: 135-136.
7. Lachmann, P.J. Lupus and desoxyribonuclease. Lupus 2003, 12:202-206.

СХЕМА ІНКУБАЦІЇ

СИМВОЛИ, ЯКІ ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ В РАМКАХ РЕАЛІЗАЦІЇ АНАЛІЗІВ ДЕМЕДІТЕК