Феритин, 96

НАЗВА ТА ПРИЗНАЧЕННЯ

Феритин є непрямим твердофазним іммуноферментним аналізом (ELISA), що призначений для кількісного виміру феритину в сироватці або плазмі людини. Цей аналіз призначений для проведення випробувань in vitro, лише у якості допоміжного засобу діагностування і терапевтичного контролю залізодефіцитної анемії.

РЕЗЮМЕ ТА ОПИС АНАЛІЗУ

20 % заліза в організмі людини (усього: 4-5 г) зворотно пов’язане з феритином, у якості внутрішньоклітинного запасного білка. Залишки заліза пов’зуються з гемоглобіном (60%) і міоглобіном або ферментами (20%).

Феритин має молекулярну масу 450 кДа і знаходиться у тканинах різних органів, наприклад печінки, селезінки, кісткового мозку і слизової кишечнику. Високо очищений феритин може розвивати червоно-коричневі кристалі. Його 24 субодиниці утворюють порожнисту сферу для зв’язування 4000 атомів заліза, пов’язаних із залишками гідроксифосфату. Білок, що не містить заліза має назву апо-феритин.  Феритин, що містить залізо, є найважливішим та найбільш специфічним зберігачем заліза більшості клітин та всього організму. У випадках захворювання на залізодефіцитну анемію, залізо може бути швидко визволене з феритину, у біо-доступній формі. [1]

Феритин можна знайти у клітинах і в крові. Це надійний параметр для вимірювання концентрації заліза в організмі людини. Концентрації феритину в сироватці залишаються незмінними упродовж біоритму – на відміну від концентрацій заліза, які змінюються постійно . Рівень вмісту заліза залежить від віку та статі пацієнтів. Регулярна втрата крові або донорства крові знижує рівень феритину. 

Детермінація феритина у сироватці пацієнта є важливим параметром діагностування та терапевтичного контролю захворювання на залізодефіцитну анемію. Негативний баланс заліза в організмі людини також знижує рівень феритину. Рівень феритину нижче 12 нг/мл свідчить про виражену залізодефіцитну анемію.  Упродовж терапії залізом, рівень феритину вказує на фактичні запаси заліза. Вимірування рівнів феритину рекомендовано проводити для пацієнтів у групах підвищеного ризику, таких як донори крові, вагітні жінки, пацієнти гемодіалізу та діти.

У деяких випадках надлишку заліза у сироватці, рівень феритину може перевищувати 500 нг/мл. У пацієнтів хворих на гемохроматоз або вторинний сидероз виявляється підвищений рівень феритину. Повна клінічна ситуація може бути оцінена тільки при розгляді усіх діагностичних параметрів [2, 3].

ПРИНЦИП ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

Антитіла анти-людського феритину пов’язані до мікролунок. Феритин, при наявності у розведеній плазмі або сироватці, пов’язуються із відповідним антигеном. Промивання мікролунок видалить невизначені компоненти сироватки та плазми. Пероксидаза хрону (HRP), кон’югований  анти-людський феритин , імунологічно виявляє пов’язаний феритин пацієнтів, що формує комплекс кон’югат/феритин/антитіло. Промивання мікролунок видалить не пов’язаний кон’югат. Субстрат ферменту у присутності зв’язаного кон’югату гідролізує форму блакитного кольору. Додавання кислоти зупинить реакцію формування кінцевого продукту жовтого кольору. Насиченість цього жовтого кольору вимірюється фотометрично при 450 нм. Інтенсивність цього кольору прямопропорційна концентрації феритину, присутнього в оригінальному зразку.

ПОПЕРЕДЖЕНННЯ І ЗАСТЕРЕЖЕННЯ

1. Усі реагенти цього набору строго призначенні лише для проведення аналізів in vitro.
2. Не слід заміняти компоненти цього набору з компонентами різних партій.
3. Компоненти, що містять людську сироватку були перевірені, і виявлені негативними на присутність поверхневого антигену вірусу гепатиту B (HBsAg), гепатиту С (HCV), ВІЛ1 та ВІЛ2 із застосуванням методів, схвалених FDA. Жоден аналіз не може гарантувати відсутність HBsAg, HCV, ВІЛ1 або ВІЛ2, тому усі реагенти, основані на людській сироватці, мають розглядатися як здатні передавати інфекцію.
4. Уникайте контакту з ТМБ (3,3´,5,5´-Тетраметил-бензидін). Якщо TMБ все ж таки потрапив на шкіру, її слід ретельно промити водою з милом.
5. Уникайте контакту з Стоп-реагентом, який містить кислоту. Якщо він все ж таки потрапив на шкіру, її слід ретельно промити водою та звернутися до лікаря.
6. Деякі компоненти набору (тобто  контрольні, буферні зразки, та буферні промивальні розчини) містять азид натрію у якості консерванту. Азид натрію (NaN3) є високотоксичною та реактивною рідиною у чистій формі. Але у концентраціях (0,09%) – він не є небезпечним. Не зважаючи на її класифікацію, як безпечна рідина, ми настійно рекомендуємо дотримуватись розумних лабораторних практик (див. 8, 9, 10).
7. Деякі компоненти набору містять Проклін 300 у якості  консерванту. При утилізації реагентів, що містять Проклін 300, слід промити каналізаційні труби рясною кількістю води, щоб розбавити реагент нижче активного рівня.
8. При роботі  зі зразками або реагентами з набору, слід одягти одноразові рукавички та ретельно вимити руки по закінченні.
9. Не піпетуйте реагенти собі до рота.
10. Заборонено ,їсти, пити, курити або наносити макіяж у зонах роботи з реагентами або зразками з набору

Уникайте контакту буферного  розчину перекису з матеріалами, що легко окислюються;

екстремальні температури можуть ініціювати самозаймання.

Дотримуйтесь керівних принципів контролю якості в медичних лабораторіях, в процесі аналізу контрольних зразків та/або змішування сироватки. У процесі роботи з реагентами, контрольними зразками та зразками сироватки цього набору, слід дотримуватись діючих правових норм.

ВМІСТ НАБОРУ

Розмір пакунку 96 визнач.

К-ть.1 Подільний мікропланшет, що містить   12 модулів, кожний   з яких має по 8 лунок, вкритих високочистими людськими антигенами. специфічні анти-людські антигени феритину (кролячі, поліклональні). Готовий до використання.

6 пробірок, 0,75 мл Калібратори феритину (A-F) у PBS/BSA матриці (NaN3 <0,1% (% відн. мас)), що містять феритин: 0; 15; 50; 150; 500 і 1500 нг/мл. Готовий до використання.

2 пробірки, 0,75 мл Контрольні зразки феритину у PBS/BSA матриці (NaN3  <0.1% (відн. мас) позитивні (1) та негативні (2), щодо відповідних концентрацій, див. прикладену вставку пакунку. Готовий до використання.

1 пробірка, 15 мл Зразок буферного розчину (Tris, NaN3 <0,1 % (відн. мас)), жовтого кольору, Готовій до використання.

1 пробірка, 15 мл Розчин  кон’югату фермента  (PBS, ПРОКЛІН 300  <0,5%  (вміст/вміст)),  (світло-червоний) що містить поліклональний кролячий анти-людський IgG; маркірований пероксидазою хрону. Готовий до використання.

1 пробірка, 15 мл Розчин субстрату ТМБ. Готовий до використання.

1 пробірка, 15 мл Стоп-реагенту (містить кислоту). Готовий до використання.

1 пробірка, 20 мл Промивний розчин (PBS, NaN3 <0.1% (вміст/вміст)), концентрат (50x).

ЗБЕРІГАННЯ І СТАБІЛЬНІСТЬ

1. Зберігати набір при 2-8 °C
2. Зберігати мікропланшети в герметичній упаковці з вологопоглиначем.
3. Реагенти стабільні до закінчення терміну придатності набору.
4. Не піддавати реагенти дії тепла, сонячних променів або інтенсивного світла упродовж зберігання або користування ними.
5. Розведений буфер для зразків або промивний буфер стабільні як найменш 30 днів, якщо їх зберігати при 2-8 °C.

НЕОБХІДНІ МАТЕРАЛІ

Обладнання

– Зчитувальний пристрій для мікропланшетів, здатний до виконання кінцевих вимірювань при 450 нм

– Багатоканальний диспенсер або піпетка-дозатор на 100 µл

– Віхровий змішувач

– Піпетки на 10 µл, 100 µл та 1000 µл

– Лабораторний таймер

– Програмне забезпечення для стиснення даних

Підготування реагентів

– Дистильована або де іонізована вода

– Вимірний циліндр на 100 або 1000 мл

– Пластикова тара для зберігання промивного розчину

ЗАБІР ЗРАЗКІВ, ЗБЕРІГАННЯ ТА ОБРОБКА

1. Зберіть повні зразки крові, за допомоги застосовних медичних методів, уникаючи гемолізу.
2. Зачекайте доки кров загусне та відділіть сироватку центрифугуванням.
3. Сироватка, призначена для аналізу повинна бути прозорою і не-гемолізованою. Забруднення гемолізом або ліпемією можна легко уникнути, але без втручання у перебіг аналізу.
4. Зразки можуть  зберігатися при 2-8 °C протягом до п’яти днів, або при   -20  °C  упродовж півроку.
5. Уникайте повторного заморожування та відтавання зразків сироватки. Це може привести до втрати активності ауто-антитіл.
6. Не рекомендовано проводити аналіз на термоінактивованій сироватці.

ПРОЦЕДУРНІ ЗАУВАЖЕННЯ

1. Не слід використовувати компоненти набору після закінчення терміну придатності.
2. Не слід заміняти компоненти цього набору з компонентами різних партій.
3. Роботу з матеріалами слід проводити при кімнатній температурі (20-28 °C)
4. Перед початком аналізу усі реагенти та зразки мають бути підготовлені. Почавши аналіз, його слід виконувати

 без перерви, щоб отримати найбільш надійні та стабільні результати.

5. Виконувати етапи аналізу треба лише у вказаній послідовності
6. Завжди використовуйте свіжі розчини зразків
7. Усі реагенти та зразки слід піпетувати на дно лунок.
8. Щоб уникнути перехідного забруднення, замініть наконечник між зразками та різними контрольними зразками.
9. Для отримання найкращих результатів дуже важливо ретельно промити мікролунки та видалити останні краплі промивного розчину з них.

Усі етапи інкубації мають бути точно хронометровані.

Контрольна сироватка або суміш мають бути регулярно аналізовані як невідомі, щоб перевірити дію реагентів та аналізу.

Не слід повторно використовувати мікролунки.

На етикетках кожної пробірки приведені відповідні концентрації для кожного контрольного розчину. За допомоги цих концентрацій  можна розрахувати криву калибрування  напівкількісним методом.

ПІДГОТУВАННЯ РЕАГЕНТІВ 

Підготування промивного розчину

Розведіть вміст кожної пробірки  концентрату  буферного промивного розчину  (50x)  з дистильованою 

або де іонізованою водою до отримання кінцевого об’єму 100 мл до використання. Зберігати у холоді: стабільний при 

2-8°C

 протягом не менш ніж 30 днів після приготування або до закінчення терміну зберігання, вказаному на етикетці.

ПРОЦЕДУРА ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

1. Підготуйте  достатню кількість   модулів мікролунок, щоб розмістити калібратори, контрольні розчини та зразки пацієнтів.
2. Піпетуйте 25 µл калібраторів, контрольних розчинів та зразків пацієнтів у двох примірниках у лунки.

SA-SF Стандарти At o F

P1, P2… зразки пациєнтів 1, 2 … C1: позитивний контр. розчин

3. Піпетуйте 100 µл буферу – зразку у кожну лунку
4. Інкубуйте 30 хвилин  при кімнатній температурі (20-28 °C). Видаліть розчини з мікролунок та промийте їх 3 рази додав 300 µл промивного розчину.
5. Розподіліть 100 µl ферментного кон’югату у кожну лунку.
6. Інкубуйте суміш протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.
7. Видаліть розчини з мікролунок та промийте їх 3 рази додавши 300 µл промивного розчину.
8. Розподілить 100 µл розчину ТМБ-субстрату в кожну лунку.
9. Інкубуйте суміш протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.

Додайте 100 µл стоп-реагенту у кожну лунку модулю та інкубуйте протягом 5 хвилин при кімнатній температурі.

Зніміть показники оптичної щільності при 450 нм та розрахуйте результати. Рекомендується виконати біхроматичне вимірювання з діапазоном 600-690 нм.

Отриманий колір стабільний протягом принаймні 30 хвилин. Упродовж цього часу, зніміть показники оптичної щільності.

Автоматизація

Аналіз ДЕМЕДІТЕК Феритин  ELISA  придатний до використання на відкритих автоматизованих процесорах ELISA . Процедура аналізу, що зазначена вище, може проводитися як за допомоги автоматичних засобів, так і без них.

ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ 

Контроль якості

Цей аналіз дійсний лише,  якщо оптична щільність при 450 нм для позитивного контрольного розчину (1) та негативного контрольного розчину (1), а також для калібраторів A і F відповідає відповідному діапазону, що приведений у Сертифікаті контролю якості, прикладеному до кожного набору! У випадку недотримання будь-якого з цих критеріїв, результати тесту є недійсними та процедуру слід повторити.

Результати розрахунків

При проведенні аналізу Феритину ELISA, пристрій на 4 параметри з лінійно-логарифмічними координатами для визначення оптичної щільності та концентрації є обраним методом обробки даних.

Рекомендований лінійно-логарифмічний графік

По перше, вирахуйте середній показник оптичної щільності для кожної лунки калібратора. Використовуючи папір лінійно-логарифмічного графіка побудуйте графік відносин середнього показника оптичної щільності кожного калібратора до концентрації. Виберіть найліпшу згладжену криву, що апроксимує шлях усіх точок калібратора. Точки калібратора можуть також бути з’єднані прямою лінією сегментів. Концентрація невідомих елементів, може тоді бути визначена по калібрувальній кривій шляхом інтерполяції.

Приклад вирахування

На малюнках нижче зображені стандартні результати  для  Аналізу Феритину ELISA. Такі дані наведені лише з метою демонстрації та не можуть бути використані для вирахування результатів іншої партії.

Калібратори

Інтерпретація результатів

При проведенні  аналізу Феритину  у нормальному діапазоні показників зразків сечі і сироватки/плазми  здорових донорів крові, були визначені наступні результати:

взято у: Томас: Labor und Diagnose. Хоакім П. Кальтвассер

Рекомендується, щоб в кожній лабораторії були встановлені власні нормальні та патологічні показники рівня феритину.

Такі показники мають розглядатися лише у  якості   інструктивних матеріалів.

ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИКОНАННЯ Паралелізм

При розведенні, зразки сироватки з підвищеними концентраціями феритину було проаналізовано Набором аналізу на Феритин.

Аналіз показав лінійність упродовж усього діапазону вимірювань.

Збіжність (Відтворюваність)

Статистика  коефіцієнтів варіації (CV) була розрахована для кожного з трьох зразків, отриманих з 24 визначень з одної партії  для  внутрішньо-аналітичної збіжності. Збіжність від партії до партії була вирахувана з результатів  5 різних партій, що мали по 6 визначень кожна:

Чутливість

При показниках 5 нг/мл спостерігалася нижча межа виявлення Феритину.

Специфічність

Анти-сироватки (поліклональна, кроляча), що використовуються для покриття мікролунок і у ферментному кон’югаті, дуже специфічні для людської молекули феритину.

ПРОЦЕДУРА ОБМЕЖЕННЯ

Аналіз феритину  ELISA – це діагностичний засіб. Певний клінічний діагноз не може ґрунтуватися на результатах одного аналізу, він має бути поставлений лікарем, після вивчення усіх клінічних та лабораторних досліджень.

ІНТЕРФЕРУЮЧІ РЕЧОВИНИ

У гемолітичних (до 1000 мг/мм),  ліпемічних (до 3 г/мм тригліцеридов) або білірубінових (до 40 мг/мм) сироватках, не було виявлено інтерферуючих речовин. А також, не спостерігалося ніяких інтерферуючих дій при використанні антикоагулянтів. Проте з практичних міркувань рекомендується  уникати сильно гемолізованих або ліпемічних зразків.

БІБЛІОГРАФІЯ

1. Берд, Дж. Л. Біологія заліза в імунній функції, метаболізмі м’язів та  функціюванні неронів. J.Nutr., 2001, 131:568S-580S.
2. Доусон, Д.В.  та ін. Точність та клінічна інтерпретація аналізів  сироваткового фетитину .

Гематологічна лабораторія., 1992, 14(1):47-52.

2. Пауелл, Л.В.  та ін. Діагностування  Гемохроматоза. Ann.Interm.Med., 1998, 129:925-

931.

СХЕМА ІНКУБАЦІЇ