Антиядерні АТ профіль

НАЗВА І ПРИЗНАЧЕННЯ

Тест АNA профіль – це непрямий твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) для кількісного визначення аутоімунних антиядерних антитіл, спрямованих проти 

RNP-70, RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Центромеру В і Jo-1 у сироватці або плазмі людини. Тест призначений виключно для in vitro діагностики у якості допоміжного заходу при діагностуванні системних ревматичних захворювань.

СТИСЛИЙ ОПИС І ПОЯСНЕННЯ ТЕСТУ

Запальні з’єднувальнотканинні хвороби характеризуються ідіопатичним генезом разом з порушеннями клітинного і гуморального імунітету, системним розладом органів і хронічним перебігом хвороби. Додатково з’єднувальнотканинні хвороби показують пересічні симптоматичні особливості, що ускладнює встановлення точного діагнозу [1].

Беручи до уваги різноманітність змішаних з’єднувальнотканинних хвороб, такі розлади мають спільну серологічну характеристику; наявність антиядерних антитіл [2]. Ці антитіла спрямовані проти частин ядра і цитоплазми клітини, і велика кількість ревматоїдних хвороб характеризується наявністю одного або більше цих антиядерних антитіл [3].

Антитіла до двоспіральної ДНК (dsDNA), односпіральної ДНК (ssDNA), гістонів, ядерного рібонуклеопротеїна (RNP) і СКВ антигена (Sm) пов’язані з системним червоним вовчаком [4], тоді як антитіла до Синдрому Шегрена А (SSA/Ro) і Синдрому Шегрена В (SSB/La) можуть з’являтися в обох випадках, при системному червоному вовчаку і при Синдромі Шегрена [5, 6]. Антитіла до Jo-1 можуть спостерігатися при поліміозиті і дерматоміозиті [6], тоді як антитіла до антигену, пов’язаному зі склеродермією (Scl-70), і до центроміру можуть з’являтися у пацієнтів з прогресивним системним склерозом (PSS). Антигістонні антитіла пов’язані з системним червоним вовчаком і медикаментозним вовчаком [7], тоді як анти-RNP-антитіла пов’язані зі змішаними з’єднувальнотканинними хворобами (MCTD) і з системним червоним вовчаком (SLE) [2]. Антитіла, спрямовані проти центроміру, пов’язані з синдромом CREST.

ПРИНЦИП ТЕСТУ

Очищені антигени SS-A/Ro, SS-B/La, RNP-70, Sm, RNP/Sm, центромір B і Jo-1знаходяться у мікролунках у рядах від А до Н окремо. Антитіла до цих антигенів, при наявності в розбавленій сироватці або плазмі, зв’язуються з відповідними антигенами. Промивка лунок мікропланшету видаляє не специфічні компоненти сироватки і плазми. Кон’юговані не людські антитіла класу IgG пероксідази хріну (ПХ) виявляють зв’язані антитіла  пацієнта, утворюючи комплекс кон’югатів/антитіл/антигенів. Промивка мікролунок видаляє не зв’язаний кон’югат. Ферментний субстрат за наявності зв’язаного кон’югату гідролізує, утворюючи синій колір. Додавання кислоти припиняє реакцію, утворюючи жовтий кінцевий продукт. Інтенсивність цього жовтого кольору вимірюється фотометрично при 450нм. 

ЗАСТЕРЕЖЕННЯ І ЗАПОБІЖНІ ЗАХОДИ

1. Усі реагенти в цьому комплекті призначені тільки для in vitro діагностики.
2. Не замінюйте компоненти комплекту компонентами з різних комплектів.
3. Компоненти, що містять людську сироватку, були протестовані за методиками, ухваленими Управлінням з контролю якості продуктів і ліків США,  і показали негативний результат на поверхневий антиген гепатиту В, гепатит С, ВІЛ і ВІЛ-2. Жоден тест не може гарантувати відсутність поверхневих антигенів гепатиту В, гепатиту С, ВІЛ і ВІЛ-2, тому з усіма реагентами на основі сироватки людини треба поводитися так, ніби вони містять інфекцію.
4. Уникайте контакту з ТМБ (3,3’,5,5’-Тетраметил-бензідін). У разі попадання ТМБ на шкіру, ретельно змийте водою з милом.
5. Уникайте контакту з розчином інгібітору, який містить соляну кислоту (1 М). У разі попадання на шкіру, ретельно змийте водою і зверніться по медичну допомогу.
6. Деякі компоненти комплекту (Регулятори, Буфер зразків і Буферний розчин для промивки) містять азид натрію у якості запобіжного засобу. Азид натрію (NaN3) дуже токсичний і хімічно активний у чистій формі. У тій концентрації, у якій він міститься в продукції (0,09%), не шкідливий. Не дивлячись на те, що він класифікується, як не шкідливий, ми настійно рекомендуємо дотримуватись  чітких передбачливих інструкцій з поведінки у лабораторії (див. 8., 9., 10).
7. Деякі компоненти комплекту містять Проклін 300 у якості запобіжного засобу. Коли викидаєте реагенти, що містять Проклін 300, промийте дренажні системи великою кількістю води для того, щоб при розбавленні компонентів їх концентрація впала нижче рівня активності.
8. Одягайте одноразові рукавички для роботи зі зразками і реагентами комплекту, і ретельно мийте руки після цього.
9. Забороняється набирати рідину в піпетку ротом.
10. Забороняється їсти, пити, курити або наносити макіяж поряд зі зразками чи реагентами комплекту.
11. Уникайте контакту між буферним Розчином Перекису і матеріалами, що легко окислюються; екстремальна температура може спричинити самозаймання.

Дотримуйтесь інструкцій з проведення контролю якості в медичних лабораторіях при аналізі регуляторів і/чи змішаної сироватки. При роботі з усіма реагентами комплекту, регуляторами і зразками сироватки дотримуйтесь існуючих правових норм.

 ЗМІСТ КОМПЛЕКТУ

Розмір упаковки 12 х 8 тестів

Кількість 1 Подільний мікропланшет з 12 модулів по 8 лунок в кожному, вкритих ретельно очищеними антигенами RNP-70 (ряд A), RMP/Sm (ряд B), Sm (ряд C), SS-A (ряд D), SS-B (ряд E), Scl-70 (ряд F), Центромір В (ряд G), Jo-1 (ряд H). Готові до використання.

2 пробірки по 2.5мл Анти-ANA регулятори у матриксі сироватки/буферного розчину (Фосфатно-сольовий буферний розчин, NaN3<0,1% (у ваговому відношенні)). Негативний Регулятор (NC), Калібрувальний Регулятор (CC). Готові до використання.

1 пробірка, 20мл Буферний розчин для зразка (Трис, NaN3<0,1% (у ваговому відношенні)), жовтий концентрат (5х)

1 пробірка, 15мл Розчин ферментного кон’югата ((Фосфатно-сольовий буферний розчин, ПРОКЛІН 300 <0,5% (у об’ємному відношенні)), (блідо-червоний), що містить поліклональний заячий не людський IgG; маркірований пероксідазою хріну. Готовий до використання.

1 пробірка, 15мл Розчин субстрату ТМБ. Готовий до використання.

1 пробірка, 15мл Інгібітор (1 М соляної кислоти). Готовий до використання.

1 пробірка, 20мл Розчин для промивки (Фосфатно-сольовий буферний розчин, NaN3<0,1% (у ваговому відношенні)), концентрат (50х).

ЗБЕРІГАННЯ І СТАБІЛЬНІСТЬ

1. Зберігайте комплект при 2-8˚С
2. Тримайте лунки мікропланшета в герметичному сухому пакеті з поглиначами вологи
3.  Реагенти стабільні впродовж терміну придатності комплекту
4. Не піддавайте тестові реагенти нагріванню, сонячним променям або яркому світлу впродовж зберігання і використання
5. Розбавлений буферний розчин для зразка і буферний розчин для промивки стабільні впродовж принаймні 30 днів, якщо зберігаються при 2-8˚С

НЕОБХІДНІ МАТЕРІАЛИ

Устаткування

• Спектрофометр для мікропланшетів, здатний робити заміри кінцевої точки при 450нм
• Багатоканальний диспансер або повторювана піпетка на 100мкл
• Вихрова мішалка
• Піпетки на 10мкл, 100мкл, і 1000мкл
• Лабораторний таймер
• Програмне забезпечення для обробки інформації

Підготовка реагентів

• дистильована або деіонізована вода
• мірний циліндр на 100 і 1000мл
• пластиковий контейнер для зберігання розчину для промивки

ЗБІР ЗРАЗКІВ, ЗБЕРІГАННЯ І ОБРОБКА

1. Зберіть зразки цільної крові використовуючи прийнятні медичні методи, щоб уникнути гемолізу.
2. Дайте крові згорнутися і відокремте сироватку за допомогою центрифуги.
3. Тест-сироватка повинна бути чистою и не гемолізованою. Контамінація гемолізом або ліпемією не бажана, але не заважає аналізу.
4. Зразки можуть зберігатися при 2-8˚С впродовж п’яти днів і при -20˚С впродовж шести місяців.
5. Уникайте повторного заморожування і розморожування зразків сироватки. Це може призвести до перемінної втрати активності аутоантитіл.
6. Не рекомендується тестування термоінактивованої сироватки.

ЗАУВАЖЕННЯ ДО ПРОЦЕДУРИ

1. Не використовуйте компоненти комплекту після закінчення терміну придатності.
2. Не замінюйте компоненти комплекту компонентами з різних комплектів.
3. Усі матеріали повинні бути кімнатної температури (20-28˚С).
4. Підготовте усі реагенти і зразки до початку аналізу. Якщо тест розпочато, він повинен проводитись без перерв для отримання максимально надійних і несуперечливих результатів.
5. Виконуйте усі етапи тесту тільки в зазначеній послідовності.
6. Завжди використовуйте свіжі розчини зразків.
7. Налийте усі реагенти і зразки на дно лунок за допомогою піпетки.
8. Для уникнення забруднення при перенесенні змінюйте наконечник для зразків і різних регуляторів комплекту.
9. Для отримання найкращих результатів ретельно промивайте мікролунки і видаляйте останні краплі буферного розчину для промивки.
10. Усі інкубаційні етапи повинні бути чітко хронометровані.
11. Контрольні зразки сироватки або пули повинні перевірятися як незнайомі субстанції для перевірки ефективності реагентів і самого тесту.
12. Не використовуйте повторно лунки мікропланшету.

Для всіх регуляторів відповідні концентрації зазначені на етикетках кожної пробірки. Використовуючи ці концентрації можна вирахувати калібрувальну криву для напівкількісного зчитування результатів пацієнта.

ПІДГОТОВКА РЕАГЕНТІВ

Підготовка буфера зразка

Перед використанням розбавте вміст кожної пробірки буферного концентрату для зразка (5х) дистильованою або деіонізованою водою до кінцевого об’єму в 100мл. Зберігайте у холодильнику: стабільний при 2-8˚С впродовж принаймні 30 днів з моменту приготування або до закінчення терміну придатності, зазначеного на етикетці.

Підготовка розчину для промивки

Перед використанням розбавте вміст кожної пробірки концентрату розчину для промивки  (50х) дистильованою або деіонізованою водою до кінцевого об’єму в 1000мл. Зберігайте у холодильнику: стабільний при 2-8˚С впродовж принаймні 30 днів з моменту приготування або до закінчення терміну придатності, зазначеного на етикетці.

Підготовка зразка

Перед тестом розбавте усі зразки пацієнта буферним розчином для зразка у пропорції 1:100. Отже, змішайте 10мкл зразка з 990мкл буферним розчином зразка в полістироловій трубці. Добре перемішайте. Регулятори готові до використання і їх не потрібно розбавляти.

ПРОЦЕДУРА ВИПРОБУВАННЯ

1. Підготовте достатню кількість модулів мікропланшетів для розміщення регуляторів і попередньо розведених зразків пацієнта.
2. Налийте за допомогою піпетки 100мкл регуляторів і попередньо розведених зразків пацієнта в лунки у двох примірниках.
3. Інкубуйте впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі (20-28˚С)
4. Вилийте вміст мікролунок і промийте 3 рази 300мкл розчину для промивки.
5. Налийте 100мкл ферментного кон’югату в кожну лунку
6. Інкубуйте впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі
7. Вилийте вміст мікролунок і промийте 3 рази 300мкл розчину для промивки
8. Налийте 100мкл розчину субстрату ТМБ в кожну лунку
9. Інкубуйте впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі
10. Додайте 100мкл інгібітору у кожну лунку модулів і інкубуйте впродовж 5 хвилин при кімнатній температурі
11. Зніміть показання оптичної щільності при 450нм і підрахуйте результати. Рекомендується біхроматичне вимірювання при 600-690нм.

Утворений колір стабільний впродовж принаймні 30 хвилин. Зніміть показання оптичної щільності в цей період.

ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Контроль якості

Тест дійсний тільки якщо оптична щільність при 450нм для Негативного Регулятора (NC) і Калібрувального Регулятора (CC) відповідає відповідному діапазону, зазначеному в Сертифікаті Контролю Якості, який додається до кожного тестового комплекту! Якщо будь-який з цих критеріїв не відповідає, результат не дійсний і тест необхідно повторити.

Обчислення результатів

Обчислення результатів тесту АNA профіль здійснюється шляхом порівняння оптичної щільності зразка пацієнта з оптичною щільністю Калібрувального Регулятора.

Для кожного антигену значення ОЩ відсічення обчислюється за наступною формулою:

ОЩ Відсічення = ОЩ Калібрувального Регулятора Х Специфічний Фактор

Для кожного зразка пацієнта обчислюється 8 Заданих значень за наступною формулою:

ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Кількісна Інтерпретація 

Зразок є позитивним для будь-якого АNA параметру, якщо ОЩ Зразка > ОЩ Відсічення:

АNA Профіль

(ОЩ Зразка)

Негативний: < ОЩ Відсічення

Позитивний: ≥ ОЩ Відсічення

Для детального кількісного аналізу ми рекомендуємо застосовувати індивідуальні АNA- ELISA тестові системи.

Напівкількісна інтерпретація

Зразок є позитивним для будь-якого АNA параметру, якщо його задане значення  ≥ 1.2:

АNA Профіль

(Задане значення)

Негативний: < 1.0

Граничний: 1.0 – 1.2

Позитивний: ≥ 1.2

 ЕКСПЛУАТАЦІЙНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Призначення

Мікропланшет вкритий антигенами RNP-70, RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Центромеру В і Jo-1 відповідно. Усі препарати з антигенами, природні і рекомбінантні, ретельно очищені за допомогою афінної хроматографії. Тест АNA Профіль призначений тільки для аутоантитіл, спрямованих на ці антигени. Перехресна реактивність не спостерігалась.

Калібрування

Тест калібрований на контрольній сироватці з Центру з контролю і профілактики захворювань (CDC), Атланта, США, що отримала міжнародне визнання, оскільки ніякі інші міжнародні стандарти не доступні.

ОБМЕЖЕННЯ ПРОЦЕДУРИ

1. АNA Профіль ELISA – це допоміжна діагностика і не є по суті основною діагностикою. Конкретний клінічний діагноз не повинен базуватися виключно на результатах тесту, а повинен бути зроблений лікарем після отримання усіх клінічних і лабораторних результатів.
2. Позитивний АNA може бути виявлений у явно здорових людей.
3. Пацієнти з системним червоним вовчаком, які проходять стероїдну терапію, можуть мати негативні результати тесту.
4. Деякі ліки можуть стимулювати АNA.

ІНТЕРФЕРУЮЧІ РЕЧОВИНИ

Інтерференції з гемолітичною (до 1000мг/дл) і ліпемічною (до 3г/дл тригліцеридів) сироваткою, або сироваткою, що містить білірубін (до 40мг/дл), не спостерігалося. Також не спостерігалося ніяких інтерферуючих ефектів з застосуванням антикоагулянтів. Проте з практичних причин рекомендується уникати надмірно гемолізованих і ліпемізованих зразків.

БІБЛІОГРАФІЧНИЙ СПИСОК

1. Hiepe F., Burmester G.R.. Klinik und Diagnostik des systematischen Lupus 

erythrematodes. Dtsch.med.Wschr.; Vol.121; 1129-1133; 1996. 

2. Nakamura R.M., Tan E.M.. Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic 

rheumatic diseases. Clin.Lab.Med.; Vol.12; 1-23; 1992. 

3. Barland P., Lipstein E.. Selection and use of laboratory test in the rheumatic diseases. 

Am.J.Med.; Vol.100 (suppl 2A); 16s-23s. 

4. Isenberg D.A., Ravirajan C.T., Rahman A., Kalsi J.. The role of antibodies to DNA in 

systemic lupus erythematosus -A review and introduction to an international workshop on 

DNA antibodies held in London, May 1996. Lupus; 6; 290-304; 1997. 

5. Alexander E, Buyon J.P., Provost T.T., Guarnieri T. Anti-Ro/SS-A antibodies in the 

pathophysiology of congenital heart block in neonatal lupus syndrome, an experimantal 

model. Arthritis and Rheumatism; Vol. 35 No.2; 176-189; 1992. 

6. Hietarinta M., Lassila O.. Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic 

rheumatic disease. Ann.Med.; Vol.28; 283-291; 1996. 

7. Fritzler M.J.. Clinical relevance of autoantibodies in systemic rheumatic diseases. 

Mol.Biol.Rep.; Vol.23; 133-145; 1996. 

8. Feltkamp T.E.W.. Antinuclear antibody determination in a routine laboratory. 

Ann.Rheum.Dis.; Vol.55; 723-727; 1996. 

9. Amoura Z., Koutouzov S., Chabre H., Cacoub P., Amoura I., Musset L., Bach J.-F., Piette 

J.-C.. Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue 

diseases. Arthritis and Rheumatism; Vol. 43 (1); 76-84; 2000. 

10. Lundberg U.N., Hedfors E., Pettersson I.. Recombinant 70-kD protein for determination of 

autoantigenic epitopes by anti-RNP sera. Clin.Exp.Immunol.; 81; 52-58; 1990. 

11. Sanchez-Guerrero J., Lew R.A., Fossel A.H., Schur P.H.. Utility of anti-Sm, anti-RNP, antiRo/SS-A, and anti-La/SS-B (extractable nuclear antigens) detected by enzyme linked 

immunosorbent assay for the diagnosis of systemic lupus erythematodes. Arth.Rheum.; 

Vol.39; 1055-1061; 1996. 

12. Shen G.Q., Shoenfeld Y., Peter J.B.. Anti-DNA, anti-histone and anti-nucleosome 

antibodies in systemic Lupus erythematosus and drug-induced Lupus. Clin. Reviews in 

Allergy and Immunology; Vol.16; 321-334; 1998.

ІНКУБАЦІЙНА СХЕМА

1. Налийте за допомогою піпетки 100мкл буж-вимірника, регулятора або зразка пацієнта

Інкубуйте впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі

Вилийте вміст мікролунок і промийте 3 рази 300мкл розчину для промивки

1. Налийте 100мкл ферментного кон’югату

Інкубуйте впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі

Вилийте вміст мікролунок і промийте 3 рази 300мкл розчину для промивки

1. Налийте 100мкл розчину субстрату

Інкубуйте впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі

1. Додайте 100мкл інгібітору

Залишіть на 5 хвилин

Зніміть показання при 450нм

СИМВОЛИ, ЯКІ ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ В ТЕСТАХ DEMEDITEC